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GoldStar Best DNA Polymerase說明書

(5×GoldStar Best PCR Buffer With Mg  )2+

目錄號：K0654

保存條件：-20℃保存。

組分說明

  Cat. No.                                 K0654      K0654A      K0654C

  Kit Size                                  250 U        500 U       6×500 U

  GoldStar Best DNA Polymerase, 5 U/μl       50 μl       100 μl      6×100 μl

  5×GoldStar Best PCR Buffer                 1 ml       2×1 ml        3×5 ml

             注意：本產(chǎn)品的5×GoldStar Best PCR  Buffer中含有7.5mM鎂離子。

產(chǎn)品簡介

　　該產(chǎn)品是經(jīng)過特殊處理的熱啟動高保真聚合酶。該聚合酶具有  5′-3′DNA聚合酶活

性，5′-3′核酸外切酶活性和3′-5′核酸外切酶活性，在普通PCR條件下，與GoldStar Taq

DNA Polymerase相比，具有擴(kuò)增效率高、錯配率低的優(yōu)良性能。化學(xué)修飾使該酶在常

溫下沒有聚合酶活性，有效避免在常溫條件下由引物和模板非特異性結(jié)合或引物二聚

體而產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增，酶的激活須在 95℃下孵育10分鐘，該條件可以整合入已有

的PCR熱循環(huán)程序。優(yōu)化的緩沖體系使酶的作用發(fā)揮最大功效，實現(xiàn)對目的片段的高

保真、高特異性、高擴(kuò)增效率、高靈敏度擴(kuò)增。使用本制品擴(kuò)增得到的   PCR產(chǎn)物的3′

端附有一個“A"堿基，因此可直接用于T/A克隆。本產(chǎn)品應(yīng)用于常規(guī)的PCR、RT-PCR和

多重PCR，特別適用于對特異性、保真性和擴(kuò)增效率均有較高要求的PCR。

活性定義

　　用活性化的大馬哈魚精ziDNA作為模板/引物，在74℃，30分鐘內(nèi)，將10   nmol脫

氧核苷酸摻入到酸性不溶物質(zhì)所需的酶量定義為1個活性單位（U）。

質(zhì)量控制

　　經(jīng)過多次柱純化， SDS-PAGE檢測其純度大于99%；經(jīng)檢測無外源核酸酶活性；

PCR方法檢測無宿主殘余DNA；能有效地擴(kuò)增人基因組中的單拷貝基因；室溫存放一

個月，無明顯活性改變。

                本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途

使用方法

    以下舉例為常規(guī)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實際操作中應(yīng)根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的

    片段大小不同進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和優(yōu)化。

    1. PCR反應(yīng)體系

試劑                                     50 μl反應(yīng)體系        終濃度

5×GoldStar Best Taq PCR Buffer                10 μl                1×

dNTP Mix，2.5 mM each                       4 μl            200 μM each

Forward Primer，10 μM                      2 μl            0.4 μM

Reverse Primer，10 μM                       2 μl            0.4 μM

Template DNA                                <1 μg         <1 μg/reaction

GoldStar Best Taq DNA Polymerase，5 U/μl      0.5 μl

RNase-Free Water                             up to 50 μl

       注意：1）引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

       2）鎂離子濃度請以終濃度1.5-3 mM作為設(shè)定范圍的參考。本產(chǎn)品的5×GoldStar Best Taq PCR Buffer中已含有7.5 mM鎂離子，可根據(jù)不同引物對和模板調(diào)節(jié)鎂離子濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

    2. PCR反應(yīng)條件

步驟                 溫度              時間

預(yù)變性               95℃             10 min

變性                 94℃             30 s

退火                55-65℃           30 s     30-40個循環(huán)

延伸                 72℃             60 s

終延伸               72℃             5 min

       注意：1）一般實驗中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，無法得到理想的擴(kuò)增效率時，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。

       2）延伸時間應(yīng)根據(jù)所擴(kuò)增片段大小設(shè)定，本產(chǎn)品中所包含的GoldStar Best DNA Polymerase的擴(kuò)增效率為1 kb/min。

       3）可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯配機(jī)率會增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

       4）本產(chǎn)品須在預(yù)變性95℃，10 min條件下實現(xiàn)酶的活化。

    3.結(jié)果檢測：反應(yīng)結(jié)束后取5  µl反應(yīng)產(chǎn)物，加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

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